作为病原学诊断道路上的里程碑，宏基因组学第二代测序技术检测具有无偏倚性、广覆盖、快速等优点，能覆盖更广范围的病原体。但因一直没有相应的标准而无法在临床进行更为规范化的开展。
年11月15日，“中国宏基因组学第二代测序技术检测感染病原体的临床应用专家共识”在《中华传染病杂志》发布。共识由来自全国18家单位的共22位编写专家组成员讨论撰写。医院张文宏教授为通讯作者。
作为全球首篇针对所有感染性疾病的宏基因组学临床应用专家共识，在二代测序病原检测技术越来越普及的当下，该共识的发布对感染病原体宏基因组学病原诊断的应用具有里程碑式的重要意义，建立了中国感染病原体宏基因组学检测的标准规范，也是中国感染病原体宏基因组学的阶段性成果总结。
该专家共识就第二代测序技术的临床应用范围、样本采集、分析解读和诊断效能等方面进行证据总结和意见推荐，建立中国感染病原体宏基因组学检测的标准规范。
二代测序的临床需求与应用范围
传统的病原学诊断是临床医师根据患者的临床表现做出一系列鉴别诊断，然后针对这些进行检测，通常一项检测只能对应一种病原体，而二代测序检测能覆盖较大范围的病原体，病*、细菌、真菌、寄生虫都能被同时检测，不论临床样本培养成功与否，只要含有可检测到的DNA或RNA即可。二代测序的其他潜在应用还包括病原体的耐药基因检测、医院感染控制的监测，以及社区传染性疾病暴发的监测。
推荐意见1
若怀疑细菌、真菌、DNA病*、寄生虫、不典型病原体感染且需进行二代测序检测时，建议采用DNA检测；若怀疑RNA病*感染时，则建议采用RNA检测。
推荐意见2
对于临床疑似感染的病重、病危或免疫抑制、免疫缺陷患者，建议在完善传统实验室及分子生物学检测的同时，采集疑似感染部位的标本进行二代测序。
二代测序的适用范围
目前，已有多项研究报道二代测序可提高感染中的病原学检测能力，研究聚焦在临床包括细菌、病*、真菌、寄生虫等多类病原体；研究范围覆盖包括中枢神经系统、血流、呼吸道、局灶感染等多种临床感染类型。
二代测序在临床疑似中枢神经系统感染中的适用范围
在常见病原体之外，二代测序在中枢神经系统感染中已成功检测到多种新发及少见病原体，如羊布鲁菌、星状病*、热带假丝酵母、狒狒巴拉姆希阿米巴等。对于慢性中枢神经系统感染的患者，二代测序检测罕见、少见病原体的能力可显著提高患者病原学确诊的概率。
推荐意见3
对于怀疑中枢神经系统急性感染的患者，如有条件，推荐在抽取脑脊液时同步留取2mL脑脊液标本保存于-16~20℃冰箱。在完成常规生物化学检查和培养之后，若3d内未获得明确的病原学依据且经验性抗感染治疗无效，推荐对留存的脑脊液标本进行二代测序检测。若未留存标本，可重新采集标本。
推荐意见4
对于疑似中枢神经系统病*感染的患者，如有条件，推荐在抽取脑脊液时同步留取2mL脑脊液标本保存于-16~20℃冰箱。在传统PCR分子检测（包括多重探针分子PCR方法）后若未能获得明确的病原学依据，推荐对留存的脑脊液标本进行二代测序检测。若未留存标本，可重新采集标本。
推荐意见5
对于慢性中枢神经系统感染及需要随访病原学证据的患者，可首选二代测序进行检测。
二代测序在临床疑似血流感染中的适用范围
血流感染的非选择性二代测序检测范围涵盖细菌、真菌、病*（鼻病*、腺病*、CMV等）、不典型病原体（柯克斯体、巴尔通体等）。由于大部分血流感染的病原体［包括细菌、真菌、寄生虫（如疟原虫）、部分病*（如疱疹病*）］均以DNA作为遗传物质，所以推荐将DNA二代测序作为血流感染的首选检测方法，仅在不能排除RNA病*感染（如肾综合征出血热、登革热、病*性肺炎等）时推荐进行RNA测序。
推荐意见6
对于怀疑血流感染的患者，如有条件，推荐在抽取血培养标本时同步留取2mL血标本，分离血浆后保存于-16~20℃冰箱，血培养3d未报阳且经验性抗感染治疗无效时，推荐对留存血标本进行二代测序检测。若未留存标本，可重新采集标本。
推荐意见7
对于怀疑继发性血流感染的患者，在原发感染灶的病原学检测为阴性或因各种因素无法送检合适标本的情况下，可考虑将血标本的二代测序检测作为二线检测方法。二代测序在临床疑似局灶性感染中的适用范围
局灶性感染是除血流感染、中枢神经系统感染、呼吸道感染外，以局部组织出现感染性症状如红、肿、热、痛、扪及波动感、有脓液渗出为表现的一类疾病。目前，已有多项研究报道二代测序可提高皮肤软组织感染、骨关节感染、眼内感染、尿路感染、浆膜腔感染、其他组织感染中的病原学检测能力。
推荐意见8
对于怀疑局灶性感染的患者，在对局灶部位完成常规的生物化学、培养或PCR检测后，若未能获取病原学诊断结果，推荐将二代测序作为二线首选检测手段。
二代测序在临床疑似呼吸道感染中的适用范围
根据二代测序原理，可对包括呼吸道定植菌群和引起感染的病原菌同时进行检测。可在24~72h内鉴定标本中可能存在的常规方法无法鉴定的罕见病原体、病*等。并可对多重感染进行鉴定。
推荐意见9
对于呼吸道感染患者，若2d内未通过传统实验室检查获得明确的病原学依据且经验性抗感染治疗无效，推荐留取呼吸道标本进行二代测序检测。
推荐意见10
对于高度怀疑病*性肺炎且病情持续进展的患者，可先完善呼吸道病*多重PCR检测，若为阴性，再行二代测序检测，并应同时进行核酸RNA反转录。
二代测序的流程与质量控制
样本采集针对患者感染部位的不同，采集的样本类型主要包括静脉血、脑脊液、痰液、肺泡灌洗液、胸腔积液、腹水、组织、咽拭子、局灶穿刺物等多种类型。
推荐意见11
采集样本送检二代测序必须严格遵守无菌原则。
推荐意见12
样本应直接从患者感染部位的体液或组织中进行采集。
推荐意见13
当患者存在感染表现但病情危重或不能耐受有创操作时，可考虑采集患者的血液标本送检。
样本前处理／核酸抽提及文库建立
推荐意见14
实验室在充分保障生物安全性的前提下，应建立完整的核酸检测流程（样本采集，样本前处理／核酸抽提及文库建立，质量控制及生物信息分析，二代测序结果的实验室判读）。
标注：核酸的质量是决定二代测序成功的关键推荐意见15
每批次实验中都应包括内参照、阴性对照品和阳性对照品。每批次实验均需严格评估是否存在操作或环境带来的污染。单个样本测序数据量特异性序列片段数建议不低于2×条（即20M特异性序列数），此外建议测序序列读长不少于单端50bp。
质量控制及生物信息分析
质量控制体系应包含多个质量控制点，依次为样本运输温控、提取浓度与纯度、出库浓度、文库片段分布、下机总数据量、测序质量（Q20、Q30比率）等，分别监控运输温度、核酸提取、文库构建、下机数据可靠性等方面，任何不符合质量控制标准的检测都应及时终止，重新检测，或在无法重新检测的情况下可提供预警，以供临床参考。
推荐意见16
对数据进行分析时，建议采用临床应用级别的数据库，审慎使用公共数据库。
推荐意见17
建议二代测序检测病原体的报告应涵盖该批次实验中的内参照、阴性对照品和阳性对照品结果，并记录相关质量控制标准，如单个样本数据量、序列读长，以及相关的质控参数。
二代测序结果的临床应用建议及其临床判读、验证
已有的报道和研究均提示，二代测序对包括中枢神经系统感染、血流感染和呼吸道感染在内的各部位感染均有一定的临床应用价值。在某些临床场景中，二代测序不仅有助于进行快速、精准的诊断，而且也对制订抗感染治疗方案及后续疗效评估具有指导作用。
推荐意见18
二代测序结果应在与患者临床表现及实验室检查密切结合的前提下进行解读和验证。
推荐意见19
对于疑似中枢神经系统、血流、呼吸道感染或需排除感染性疾病的患者，根据推荐意见1至13采集合适的样本进行二代测序，根据送检样本类型结合患者的临床表现及其他结果辅助判断或排除诊断，同时应注意排除检出病原体定植的情况。
推荐意见20
对于二代测序结果为阴性，但根据其他辅助检查结果（如培养结果）高度提示感染可能的尚不能排除感染的患者，建议必要时再次取样重复二代测序检测。
二代测序在临床感染性疾病中针对不同病原体类型的诊断效能
推荐意见21
在中枢神经系统感染中，目前证据提示二代测序检测细菌、寄生虫、病*的效果较好，而中枢神经系统真菌感染仍需更大样本量的临床试验来检验其检测效能。
推荐意见22
对于脓*症患者，推荐联合采用传统实验室培养和二代测序来提高病原学的检出率。
推荐意见23
对于局灶脓肿或组织感染患者，二代测序的总体灵敏性和特异性均较好，其中对细菌检测的灵敏性优于真菌。
推荐意见24
对于呼吸道感染，二代测序在病*及少见病原体的检测中体现出较好的检测效能；但在细菌、真菌等病原体的检测中，二代测序尚不能准确判断菌群定植或感染状态，仍需依赖临床医师结合患者病情进行进一步分析。
推荐意见25
对于结核分枝杆菌、伤寒沙门菌、布鲁菌等胞内菌，以及具有细胞壁的真菌，二代测序的检测效能会相对降低，应对上述菌群设置特定的序列数阈值。
推荐意见26
对于新发、罕见、疑难感染性疾病，以及免疫缺陷患者，二代测序能显著提高病原体的检出率，可作为上述疾病的一线检测手段。
二代测序在成本经济效益分析下的临床应用推荐
推荐意见27
目前，开展二代测序的成本仍较高，尚不能作为轻症感染性疾病的一线检测手段。
本次共识遵循循证医学原则，共引用54篇文献，其中中国19篇，占比35%，彰显了中国宏基因组学技术在感染性疾病精准诊疗应用中的成果和国际先进地位。共识就第二代测序技术的临床应用范围、样本采集、分析解读和诊断效能等进行了证据总结，给出27条推荐意见，首次针对不同感染症候群、不同病原体的适用范围给出了相应的推荐意见，并在共识中多次强调质量控制与数据量的重要性。
南京诺因生物科技有限公司总部坐落于江苏省南京市江北新区生物医药谷，专注应用领先的基因技术助力临床感染病原的诊疗，诺因（KnoinDX）取“KnowInfectionThroughGeneTech（通过基因科技破解感染）”的含义，寓意企业的宗旨是应用基因科技帮助医生破解病原体感染的难题。预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇